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技術(shù)服務(wù)
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串聯(lián)親和純化(TAP)-鑒定互作蛋白質(zhì)
串聯(lián)親和純化(tandem affinity purification, TAP)技術(shù)基本原理包括:重組構建帶有兩種親和純化標簽的融合靶蛋白,然后轉染到宿主細胞或組織,帶標簽的靶蛋白表達并結合上相關(guān)蛋白質(zhì)后,利用標簽與相應磁珠作用,兩步純化得到相關(guān)蛋白質(zhì)。
 
TAP技術(shù)的主要優(yōu)點(diǎn):①可以在細胞生理狀態(tài)下或者接近生理狀態(tài)表達融合靶蛋白,研究靶蛋白及其未知的相關(guān)蛋白復合體,更真實(shí)地反映蛋白質(zhì)在生物體內的功能;②經(jīng)過(guò)兩次洗脫,降低了非特異蛋白量,相比較于酵母雙雜交更敏感,更少假陽(yáng)性.TAP技術(shù)屬于蛋白質(zhì)組學(xué)中“Bottom-up”策略之一,對研究蛋白質(zhì)功能有很強的實(shí)用性。TAP技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜對純化后的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析,通過(guò)生物信息學(xué)獲得的蛋白相關(guān)性可信度高,為后續的驗證工作節省大量時(shí)間。TAP聯(lián)用質(zhì)譜,以檢測在細胞內與FGF1分子相互作用的蛋白質(zhì)為例,實(shí)驗過(guò)程如下:
 
 

質(zhì)譜鑒定實(shí)驗流程(膠內酶解或溶液內酶解)
1:膠內酶解

2:溶液內酶解
  
 
使用儀器
Thermo Scientific Q Exactive 
(高分辨質(zhì)譜)


技術(shù)優(yōu)勢
適合中度復雜的蛋白質(zhì)樣品, 如相互作用的蛋白質(zhì)條帶和洗脫液; 高準確性, 高靈敏度。


實(shí)驗報告內容
1、相互作用蛋白質(zhì)譜鑒定結果(excel 列表);
2、完整的實(shí)驗步驟、使用儀器、試劑來(lái)源、軟件檢索參數等。
 
蛋白樣品送樣要求

樣品樣品要求
SDS-PAGE條帶考染,條帶清晰可見(jiàn)
蛋白質(zhì)溶液蛋白質(zhì)總量>5μg,濃度>0.1μg/μl;
說(shuō)明裂解液和洗脫液成分,濃度信息
 

                                 
實(shí)驗樣本預處理及運輸注意事項
為保證高質(zhì)量的技術(shù)服務(wù)結果,請您參照以下說(shuō)明對實(shí)驗樣本進(jìn)行處理和保存:
⊙蛋白洗脫液:定量并計算總蛋白量,真空干燥后,密封好管口,冰袋包裝寄送。
⊙蛋白質(zhì)條帶(考染):從凝膠上割取條帶時(shí),避免污染,將條帶放入EP管內,密封好管口,冰袋包裝寄送。
特別提醒:快遞寄送樣本運輸過(guò)程中,可能晃動(dòng)幅度會(huì )比較大,請做好基本運輸防護措施。
注:在寄送樣本時(shí),請填寫(xiě)好樣本登記表,隨樣本一同寄往本公司。
 

參考文獻:

Jayantha Gunaratne, et al. (2011) Protein Interactions of Phosphatase and Tensin Homologue (PTEN) and Its Cancer-associated G20E Mutant Compared by Using Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture-based Parallel Affinity Purification.  JBC, VOL. 286, NO. 20, pp. 18093–18103

Cezary Waszczak, et al.  (2014) Sulfenome mining in Arabidopsis thaliana. PNAS,  vol. 111,  no. 31, 11545–11550

Theresia D. et al. (2016) The neurofibromin recruitment factor Spred1 binds to the GAP related domain without affecting Ras inactivation.  PNAS, Vol. 113 no. 27.  7497–7502
 
Zhen C, et al. (2016) Proteomic Analysis Reveals a Novel Mutator S (MutS) Partner Involved in Mismatch Repair Pathway, Molecular & Cellular Proteomics, 15, 1299-1308. 
 
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