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常見(jiàn)問(wèn)題
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1、免疫共沉淀(co-IP)實(shí)驗思路如何選擇?是coIP-WB,還是coIP-MS?

Co-IP(免疫共沉淀,co-inmunoprecipitation)是經(jīng)典的利用抗體從樣品中捕獲靶蛋白及其互作蛋白、復合體的一項技術(shù),能夠特異性富集所研究的目的蛋白。由于過(guò)程中采用了非變性條件,保留了互作及復合體的細胞內狀態(tài)。相對于酵母雙雜交、pull down等方法,其特色之一便是捕獲的蛋白互作發(fā)生在所研究的特定組織細胞內,保存了互作蛋白及復合體的“內源”狀態(tài)。

Co-IP實(shí)驗原理:以抗體和抗原之間的專(zhuān)一性作用為基礎的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法,是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時(shí),完整細胞內存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。如果用蛋白質(zhì)X的抗體免疫沉淀X,那么與X在體內結合的蛋白質(zhì)Y也能沉淀下來(lái)。

Co-IP1.png
一般常規思路,如果想鑒定一個(gè)蛋白的未知的互作蛋白,可以選擇CoIP-MS,用質(zhì)譜的方法對IP拉下來(lái)的產(chǎn)物蛋白進(jìn)行篩選鑒定。而想鑒定驗證兩個(gè)蛋白在細胞內結合互作,可以采用co-IP與Western blotting聯(lián)用的方法。


2、Label-free蛋白質(zhì)組定量檢測有哪些好處?

不同于TMT法或iTRAQ法需要穩定同位素標記,非標記(label-free)蛋白質(zhì)組質(zhì)譜定量檢測的優(yōu)點(diǎn)就是樣品上機前,不需要特殊標記操作,操作非常方便,也節省了標記試劑的費用。我們使用Maxquant軟件進(jìn)行分析,可以做到定量檢測。Maxquant軟件非標記定量分析是以MS1為基礎,然后提取XIC進(jìn)行定量。實(shí)驗證明結合Maxquant軟件分析的非標記技術(shù)具有較好的定量準確性和可靠性。

不可否認,Label-free法也有自身的弱點(diǎn)。Label free定量主要采用DDA采集的一級質(zhì)譜的信號進(jìn)行定量,而母離子挑選中受干擾很大,容易造成定量不準。所以我們建議客戶(hù)做Label free定量法對同一樣品至少做三次重復檢測。

3、什么是TMT串聯(lián)質(zhì)譜標記法?與iTRAQ相比,有什么不同之處?

串聯(lián)質(zhì)譜標記(Tandem mass tag,TMT)氨基反應的穩定同位素標簽。由于是同質(zhì)標簽(isobaric),多個(gè)不同形式的標簽帶,TMT標記現在最多可以做到10標,也就是說(shuō)可以同時(shí)平行做10個(gè)樣品的蛋白質(zhì)譜定量檢測。

 

        

        圖 1: (a)iTRAQ和 (b)TMT試劑的結構示意圖                                           圖2:Thermo Scientific TMT試劑– TMT10

 

 

TMT和ITRAQ的本質(zhì)原理都是等重同位素標簽(isobaric mass tags),化學(xué)反應原理和用來(lái)定量的原理都是相同的。在液質(zhì)聯(lián)用分析檢測過(guò)程中,同質(zhì)報告標簽在二級質(zhì)譜檢測中反映所標記的肽段的分度。TMT和ITRAQ所不同的是化學(xué)結構不同,分別有Thermo公司與ABSCIEX公司的商業(yè)產(chǎn)品。

       

                              圖3: 同質(zhì)同位素標記法工作流程

參考文獻:

TMT法:

Jump up to:a b Thompson A, Schäfer J, Kuhn K, et al. (2003). "Tandem mass tags: a novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS". Anal. Chem. 75 (8): 1895–904.

 

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